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斑点叉尾鲴线粒体DNA控制区结构和群体遗传多样性分析 秦钦
摘要：经克隆测序获得了我国5个批次引进的40尾斑点义尾鲴(Ictaluruspunctatus)群体的线粒体控制区全序列，研究控制区序列结构和群体遗传变异。结果显爪：比对长度包括906个位点，共有变异位点28个，约信息位点21个。通过与GenBank中其它鱼类的mtDNA控制区序列进行结构分析，将斑点又尾鲴的控制区分为终止序列、lf1央保守区和保守序列区3个区域；并找到了一一系列保守序列：包括终止相关序列TAS，中央保守的CSB—F、CSB—E、CSB—D和保守序列区的CSB一1、CSB一2、CSB一3。样本总体遗传多样性指数较高，40尾个体含柯25个单倍型，其总体单倍型多样性指数(H)为0．92051，总体核苷酸多样性指数(仃)为0．00553。各群体遗传多样性分析结果表明，2001群体(2001年出生的群体，下类同)的单倍型多样性指数最高(0．92857)，1997群体最低(0．78571)各群体问的遗传距离较小，其中1999群体与2003群体及2004群体问的遗传距离最大(0．008)，1997群体与2001群体间的遗传距离最小(0．003)。1999群体的内部遗传距离较大(0．007)，1997群体的内部遗传距离最小(0．003)。5个群体的总体遗传分化指数为0．1075(P<0．001)，其中大部分遗传变异存在f各地婵群体内部(89．25％)，存在于群体问的遗传变异较小(10．75％)。毕业论文下载网www.biyeda.com/
关键词：斑点叉尾鲴(Ictaluruspunctatus)；线粒体DNA控制区；遗传多样性
斑点叉尾鲴(Ictalurespunctatus)亦称美洲鲶、沟鲶，属于鲶形目鲴科，自然分布于美国中南部、加拿大南部和大西洋沿岸部分地区。1984年首次由美国引入我国，目前已成为我国重要的淡水养殖品种之一。
在当前我国斑点叉尾鲴苗种种质退化严重，原种亲鱼数量越来越少的背景下，中国水产推广总站联合江苏、四川、江西等地水产科研部门系统开展斑点叉尾鲴育种[作。在联合育种工作中，我们面临着原种亲鱼数量有限，育种群体遗传背景信息缺失等不利条件。在这种情况下，深人开展斑点叉尾鲴种群的遗传结构及遗传多样性水平研究，有助于我们了解该物种引进群体的遗传结构和种群恢复潜力，从而有针对性地制定保护和管理策略。
线粒体DNA(mtDNA)具有母系遗传和进化速率较快等优点，j见已成为探讨物种系统发生和种内遗传分化的有效遗传标记。mtDNA控制区(D—loop)为非编码区，因缺乏编码的选择压力而比其它线粒体基因的进化速率更快_1J，其在近缘物种系统进化以及群体遗传学等方面的应用颇为广泛。本研究通过测序获取了我国历年来所引进的5个批次斑点：疋尾鲴群体的mtDNA控制区全序列，分析了其序列结构，识别了控制区序列的终止序列区(TAS)、中央保守区(CD)和保守序列区(CSB)等区域，在此基础上研究了5个引进种群的群体遗传学特征，期望深入了解我国斑点叉尾鲴引进群体的遗传背景，发掘我国斑点叉尾鲴引进群体的遗传潜力，为斑点叉尾鲴联合育种项目积累基础数据。
1材料与方：法
1．1材料依据全国水产推广总站调研结果，先后在我国江苏、江西等地引进5个地理群体的斑点叉尾鲴亲本，分别为1997德克萨斯群体、1999阿肯色群体、2001密西西I：匕群体、2003阿肯色群体及2004阿肯色群体，数字表示群体出生年份，地名表示原种来源美国州名。1997、1999、2001、2004群体引自江苏泰兴水产良种场，2003群体引自江西峡江斑点叉尾鲴良种场，具体引进亲本种群及数量见表1。2009年6-7月，采集各群体亲鱼活体鳍条样本，置于酒精中一20℃冷冻保存备用。 1．2方法1．2．1 DNA模板制备随机抽取各地理群体鳍条样品用于测序分析，采用常规的酚．氯仿法提取基因组DNA，1％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性，紫外分光光度法检测样品DNA浓度及纯度。
1．2．2 PCR扩增及序列测定
根据GenBank中的斑点叉尾鲴线粒体基因组序列(GenBankaccessionNo．AF482987)设计上下游引物，用于线粒体D—loop序列扩增。引物为D—loop R：CAGTGTTATGCTIYI、GATT：D—loop F：GA—GA1vII]rAACTcCCACC，由上海英骏生物公司合成。PCR反应体系(TAKARA，大连宝生物科技有限公司)为50 L，其中包括10×PCRBufer5、Mg“(2．5 mmol／L)5 L、dNTP(2．5 reotol／L)3．5 L、正反向引物各1．5 L(10nmol／L)、Taq酶0．5U、DNA模板2 L(50ng／ILL)、ddH20补足体积。PCR扩增在BiometraPCR仪上进行，PCR反应共计30个循环，循环前94℃预变性5min，每个循环包括94℃变性40S，48qC退火45S，72℃延伸60S；循环结束后于72延伸10min。
扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，以标准DI2000Ladder(TAKARA)估计产物大小。将PCR产物切胶纯化后克隆至pEASY．T1载体，将重组子转化E．coilDH仅感受态细胞，均匀涂布于AmpLB平板。37℃过夜培养后，挑取菌落进行PCR验证，对含有目的片段的克隆进行扩大培养，每个个体挑取3个克隆送至上海英骏生物工程公司进行双向测序，序列一致的情况下选取1个序列用于后续分析。PCR产物纯化试剂盒及pEASY．T1载体均购自北京全式金生物技术有限公司。共计获得40尾斑点叉尾鲴的mtDNA控制区序列。
1．2．3数据统计与分析
通过双向测序获得斑点叉尾鲴线粒体D—loop序列，经SeqManIl(DNASTAR Inc)软件拼接并赋l『’人工校埘后，用ClustalX软件¨进行比对，利用Megav3．0进行序列变异分析。通过单倍型多样性(Haplotypediversity)12]和核苷酸多样性(Nucleotidediversity，叮T)分析不同地理群体的遗传多样性。通过AMOVA分析(Analysisofmolecularvarianee)研究群体内及群体问遗传变异。
2结果与分析
2．1序列变异分析通过测序总共获取了5个群体40尾斑点又尾鲴的mtDNA控制区序列，共定义了25个单倍型mtDNAD—loop序列的平均A、T、G、C碱基含量分别为31．4％、31．3％、23．5％、l3．7％；其中(；+C(％)含量较低，表现出较为明显的碱基组成偏倚性。对所测序列进行比对，结果显示906个比对位点中，共有变异位点28个，简约信息位点21个。
2．2 D-loop结构分析
将获取的mtDNA控制区序列与其它鱼类的mtDNA控制区序列进行比较，识别_r斑点又尾鲴mtDNA控制区结构(图1)。该控制区终止序列区、中央保守区和保守序列区等区域组成，包括终止相关序列TAS，中央保守区的CSB—F、CSB—E、CSB—D和保守序列区的CSB一1、CSB一2、CSB一3、斑点叉尾鲴终止区有两个TAS核心序列，核心序列(TACAT)和其反向互补序列(ATGTA)一起出现，可形成稳定的发夹结构。在中央保守区识别了保守序列：CSB—F关键序列为AGAGACCACC，是分开终止序列区和中央保守区的标志；CSB—E关键序列为AGGGAcAAAAc1丫rGTGAGGG，斑点叉尾鲴中GTGGG．box的保守序列表现为GTGAG，与Lee所报道的鲤珏；目(Cypriniformes)鱼类Crossosto—malacustre的GTGGG—box结构相似16]；CSB—D关键序列为TA1TrA·CTGGCATCTG。在保守序列区识别了三个保守序列：CSB1序列为ATrACATA—ACTCTCTCTCAAGTACATAA，CSB2序歹0为CGCG—GTAAACCCCCCTACCCCCC，CSB3序列为TCCT—GTTAAACCCCTAAACCAG。
2．3群体遗传多样性
本研究中5个群体内部Kimura双参数遗传距离(Kimura2-parameterdistance，K2-P)为0．003～0．007之间(表2)。其中1997群体内遗传距离最小为0．003，1999群体内部遗传距离较大为0．007。5个群体问的K2-P遗传距离为0．003～0．008之间。其中1997群体与2001群体间的遗传距离最小为0．003，1999群体与2003群体及2004群体间的遗传距离最大为0．008。
5个群体40尾斑点叉尾鲴的mtDNA控制区序列包括25个单倍型，总体单倍型多样性指数(H)为0．92051，总体核苷酸多样性指数(仃)为0．00553。其中2001群体的单倍型多样性指数最高为0．92857，1997群体最低为0．78571。核苷酸多样性指数(仃)以1999群体最高为0．00712，1997群体最低为0．00275。
关键词：斑点叉尾鲴(Ictaluruspunctatus)；线粒体DNA控制区；遗传多样性
斑点叉尾鲴(Ictalurespunctatus)亦称美洲鲶、沟鲶，属于鲶形目鲴科，自然分布于美国中南部、加拿大南部和大西洋沿岸部分地区。1984年首次由美国引入我国，目前已成为我国重要的淡水养殖品种之一。
在当前我国斑点叉尾鲴苗种种质退化严重，原种亲鱼数量越来越少的背景下，中国水产推广总站联合江苏、四川、江西等地水产科研部门系统开展斑点叉尾鲴育种[作。在联合育种工作中，我们面临着原种亲鱼数量有限，育种群体遗传背景信息缺失等不利条件。在这种情况下，深人开展斑点叉尾鲴种群的遗传结构及遗传多样性水平研究，有助于我们了解该物种引进群体的遗传结构和种群恢复潜力，从而有针对性地制定保护和管理策略。
线粒体DNA(mtDNA)具有母系遗传和进化速率较快等优点，j见已成为探讨物种系统发生和种内遗传分化的有效遗传标记。mtDNA控制区(D—loop)为非编码区，因缺乏编码的选择压力而比其它线粒体基因的进化速率更快_1J，其在近缘物种系统进化以及群体遗传学等方面的应用颇为广泛。本研究通过测序获取了我国历年来所引进的5个批次斑点：疋尾鲴群体的mtDNA控制区全序列，分析了其序列结构，识别了控制区序列的终止序列区(TAS)、中央保守区(CD)和保守序列区(CSB)等区域，在此基础上研究了5个引进种群的群体遗传学特征，期望深入了解我国斑点叉尾鲴引进群体的遗传背景，发掘我国斑点叉尾鲴引进群体的遗传潜力，为斑点叉尾鲴联合育种项目积累基础数据。
1材料与方：法
1．1材料依据全国水产推广总站调研结果，先后在我国江苏、江西等地引进5个地理群体的斑点叉尾鲴亲本，分别为1997德克萨斯群体、1999阿肯色群体、2001密西西I：匕群体、2003阿肯色群体及2004阿肯色群体，数字表示群体出生年份，地名表示原种来源美国州名。1997、1999、2001、2004群体引自江苏泰兴水产良种场，2003群体引自江西峡江斑点叉尾鲴良种场，具体引进亲本种群及数量见表1。2009年6-7月，采集各群体亲鱼活体鳍条样本，置于酒精中一20℃冷冻保存备用。 1．2方法1．2．1 DNA模板制备随机抽取各地理群体鳍条样品用于测序分析，采用常规的酚．氯仿法提取基因组DNA，1％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性，紫外分光光度法检测样品DNA浓度及纯度。
1．2．2 PCR扩增及序列测定
根据GenBank中的斑点叉尾鲴线粒体基因组序列(GenBankaccessionNo．AF482987)设计上下游引物，用于线粒体D—loop序列扩增。引物为D—loop R：CAGTGTTATGCTIYI、GATT：D—loop F：GA—GA1vII]rAACTcCCACC，由上海英骏生物公司合成。PCR反应体系(TAKARA，大连宝生物科技有限公司)为50 L，其中包括10×PCRBufer5、Mg“(2．5 mmol／L)5 L、dNTP(2．5 reotol／L)3．5 L、正反向引物各1．5 L(10nmol／L)、Taq酶0．5U、DNA模板2 L(50ng／ILL)、ddH20补足体积。PCR扩增在BiometraPCR仪上进行，PCR反应共计30个循环，循环前94℃预变性5min，每个循环包括94℃变性40S，48qC退火45S，72℃延伸60S；循环结束后于72延伸10min。
扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，以标准DI2000Ladder(TAKARA)估计产物大小。将PCR产物切胶纯化后克隆至pEASY．T1载体，将重组子转化E．coilDH仅感受态细胞，均匀涂布于AmpLB平板。37℃过夜培养后，挑取菌落进行PCR验证，对含有目的片段的克隆进行扩大培养，每个个体挑取3个克隆送至上海英骏生物工程公司进行双向测序，序列一致的情况下选取1个序列用于后续分析。PCR产物纯化试剂盒及pEASY．T1载体均购自北京全式金生物技术有限公司。共计获得40尾斑点叉尾鲴的mtDNA控制区序列。
1．2．3数据统计与分析
通过双向测序获得斑点叉尾鲴线粒体D—loop序列，经SeqManIl(DNASTAR Inc)软件拼接并赋l『’人工校埘后，用ClustalX软件¨进行比对，利用Megav3．0进行序列变异分析。通过单倍型多样性(Haplotypediversity)12]和核苷酸多样性(Nucleotidediversity，叮T)分析不同地理群体的遗传多样性。通过AMOVA分析(Analysisofmolecularvarianee)研究群体内及群体问遗传变异。
2结果与分析
2．1序列变异分析通过测序总共获取了5个群体40尾斑点又尾鲴的mtDNA控制区序列，共定义了25个单倍型mtDNAD—loop序列的平均A、T、G、C碱基含量分别为31．4％、31．3％、23．5％、l3．7％；其中(；+C(％)含量较低，表现出较为明显的碱基组成偏倚性。对所测序列进行比对，结果显示906个比对位点中，共有变异位点28个，简约信息位点21个。
2．2 D-loop结构分析
将获取的mtDNA控制区序列与其它鱼类的mtDNA控制区序列进行比较，识别_r斑点又尾鲴mtDNA控制区结构(图1)。该控制区终止序列区、中央保守区和保守序列区等区域组成，包括终止相关序列TAS，中央保守区的CSB—F、CSB—E、CSB—D和保守序列区的CSB一1、CSB一2、CSB一3、斑点叉尾鲴终止区有两个TAS核心序列，核心序列(TACAT)和其反向互补序列(ATGTA)一起出现，可形成稳定的发夹结构。在中央保守区识别了保守序列：CSB—F关键序列为AGAGACCACC，是分开终止序列区和中央保守区的标志；CSB—E关键序列为AGGGAcAAAAc1丫rGTGAGGG，斑点叉尾鲴中GTGGG．box的保守序列表现为GTGAG，与Lee所报道的鲤珏；目(Cypriniformes)鱼类Crossosto—malacustre的GTGGG—box结构相似16]；CSB—D关键序列为TA1TrA·CTGGCATCTG。在保守序列区识别了三个保守序列：CSB1序列为ATrACATA—ACTCTCTCTCAAGTACATAA，CSB2序歹0为CGCG—GTAAACCCCCCTACCCCCC，CSB3序列为TCCT—GTTAAACCCCTAAACCAG。
2．3群体遗传多样性
本研究中5个群体内部Kimura双参数遗传距离(Kimura2-parameterdistance，K2-P)为0．003～0．007之间(表2)。其中1997群体内遗传距离最小为0．003，1999群体内部遗传距离较大为0．007。5个群体问的K2-P遗传距离为0．003～0．008之间。其中1997群体与2001群体间的遗传距离最小为0．003，1999群体与2003群体及2004群体间的遗传距离最大为0．008。
5个群体40尾斑点叉尾鲴的mtDNA控制区序列包括25个单倍型，总体单倍型多样性指数(H)为0．92051，总体核苷酸多样性指数(仃)为0．00553。其中2001群体的单倍型多样性指数最高为0．92857，1997群体最低为0．78571。核苷酸多样性指数(仃)以1999群体最高为0．00712，1997群体最低为0．00275。
